胡慧; 王平; 孔明望; 丁凤敏
(湖北中医学院，武汉430061)
HuHui, WangPing, KongMingwang, DingFengmin
HuBei University of Chinese Medicine, WuHan, China 430061
[原文（英文）标题] The effect and potential mechanism of replenishing kidney-essence,removing phlegm therapy on CaMKII- α on hyperphos- phorylation for AD rat model.
[摘 要] 目的 观察补肾化痰法对AD模型大鼠CaMKII-α活性的影响并探讨其可能机制。方法 应用脑立体定向技术给大鼠BNM注射凝聚态Aβ25-35＋IBO构建AD模型。注射2周后，高、中、低量组分别给大鼠该药水煎液灌胃；西药组用哈伯因混悬液灌胃；正常组、空白组、模型组均给予等容积的生理盐水灌胃。28天后采用原位杂交法检测海马神经元CaMKII-α水平的变化。结果 在正常大鼠的脑海马部位少见CaMKII-α免疫阳性表达，正常组与空白组无明显差异(p>0.05)，而在模型组可见大量的棕黄色CaMKII-α免疫阳性表达，与正常组相比，具有统计学差异（P<0.01）。西药组与模型组比较无差异(p>0.05)，中药中高量组阳性表达较模型组均有所减少（P<0.01）。低量组与模型组无差异(p>0.05)，但与西药组有一定差异（P<0.05）。结论 补肾化痰法可以可能通过抑制CaMKII-α的活性，降低Tau蛋白异常磷酸化水平，从而发挥其抗老年性痴呆的作用。
[关键词] 补肾化痰法；Alzheimer；钙/钙调素依赖的蛋白激酶II-α ；Tau蛋白
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种以进行性记忆障碍和智能衰退
为主要临床特征的中枢神经系统退行性疾病，随着人口老龄化的日趋严重，AD已经成为危害老年人健康的主要疾病之一。AD患者的特征性病理改变包括神经原纤维缠结（Neurofibrillary tangle,NFT）、老年斑（Senile plaques ,SP）和颗粒空泡变性。NFT在神经元胞体内，由高度磷酸化的Tau蛋白聚集形成，其数目和AD的痴呆程度密切相关，因此有人认为Tau蛋白的过度磷酸化是AD 的核心病变[1]。在几种Tau蛋白激酶中，钙/钙调素依赖的蛋白激酶II (calciurn/calmodulin-dependent protein kinase,CaMK II)- α与AD关系密切，在Tau蛋白过度磷酸化中起着重要作用[2-3]，所以抑制CaMKII-α表达，降低Tau蛋白的过度磷酸化对防治AD有重要指导意义。
本病目前尚无特效的治疗方法，西医主要是对症治疗，药物价格昂贵，毒副作用较大，不能支持老年人用药的要求。中医药在延缓衰老以及衰老相关疾病的防治方面有着丰富的理论和实践经验，以其疗效较好、综合效益高、副作用少而显示了良好的前景。为此我们首先建立了大鼠AD模型，并采用原位杂交法检测海马神经元CaMKII-α水平的变化，同时观察补肾化痰法对AD模型大鼠CaMKII-α水平的影响，并用哈伯因混悬液作对照,旨在进一步探讨中药治疗AD的作用及机理所在。
1 材料
1.1 动物 15月龄Wistar大鼠70只，雌雄各半，体重450±50g，由湖北省实验动物研究中心提供。
1.2 主要试剂 Aβ25-35和IBO购于Sigma公司，CAMK-Ⅱ原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.3 主要仪器和设备 脑立体定位仪（北京硕林苑科技有限公司），H600透射电子显微镜（日本日立公司），倒置显微镜（CK2，奥林巴斯公司）。
1.4 药物 补肾化痰方由制首乌、石菖蒲、竹节参、茯苓、陈皮、半夏、白芥子等组成,购自湖北中医学院国医堂门诊部。中药水煎常圧浓缩，低、中、高剂量组分别制成相当于含生药0.5g/ml、1g/ml 和2g/ml的浓缩液，4℃冷藏备用。哈伯因,河南众生制药股份有限公司豫中制药厂,批号:060321
2 方法
2.1 实验分组 ①Aβ25-35+IBO模型组（简称模型组）②假手术组（简称空白组）③正常组④哈伯因治疗组（简称西药组）⑤补肾化痰法高剂量组（简称高量组）⑥补肾化痰法中剂量组（简称中量组）⑦补肾化痰法低剂量组（简称低量组）
2.2 AD模型构建 参照本课题组前期已成功制作的复合AD大鼠模型[4]方法造模。除正常组和空白组外，其它大鼠用 2％戊巴比妥钠（40mg/Kg）腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定位仪上，颅顶正中切开暴露至颅骨，根据大鼠颅脑立体定位图谱，对基底核立体定位（位置:前囟后 3.8mm，中线旁开 2.5mm，深度 3mm），用牙科钻钻开颅骨，用 1μl 微型进样器注射针5min 内缓慢注入Aβ25-35+IBO混合液 1µl，予以留针 10min。注射完毕后以局部软组织封闭针孔，缝合皮肤。术后给予青霉素钠盐 5 万单位肌注，每天一次，连续 3 天。
空白组在定位下给予大鼠Meynert基底核一次性注射 1μl 灭菌生理盐水。正常组大鼠不做任何处理。
2.3 给药 脑内注射2周后给药。给药量均按人与大鼠体表面积系数比确定，以临床人用药等效剂量做为中剂量，模型组、空白组、正常组给予生理盐水灌胃。西药组给予哈伯因混悬液灌胃。高量组、中量组、低量组分别给予补肾化痰方水煎液灌胃。均为1ml/100g·d，连续28天。
2.4 原位杂交法检测海马神经元CaMKII-α水平的变化 石蜡切片经常规脱蜡，水洗，在切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀），37℃或室温消化15min。用PBS洗3次，蒸馏水洗1次后固定。按每张切片20μl加预杂交液。恒温箱38-42℃杂交过夜，37℃左右水温的2×SSC洗涤5min×2次；37℃0.5×SSC洗涤15min×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15min×1次，滴加封闭液、生物素化鼠抗地高辛、SABC，用PBS洗5min×3次，再滴加生物素化过氧化物酶，用PBS洗后使用DAB显色试剂盒1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上，显色，酒精脱水，二甲苯透明，封片。
2.5 统计处理
所有计量检测结果以均数±标准差（ ）表示。采用SPSS FOR WINDOWS 15.0统计软件包统计分析。
3 结果
实验结束，模型组、西药组和低、中量组分别死亡大鼠3、1、1、1只。原位杂交实验分析在正常大鼠的脑海马部位少见CaMKII-α免疫阳性表达，正常组与空白组无明显差异(p>0.05)，而在模型组可见大量的棕黄色CaMKII-α免疫阳性表达，与正常组相比，具有统计学差异（P<0.01）。西药组与模型组比较无差异(p>0.05)，中药中高量组阳性表达较模型组均有所减少（P<0.01）。低量组与模型组无差异(p>0.05)，但与西药组有一定差异（P<0.05）。中高剂量组之间无显著性差异(p>0.05)。
补肾化痰法对大鼠脑组织CaMKII-αmRNA表达的影响（ ）
| 组 别 n 平均光密度 |
| 正常组 10 96.17±17.38空白组 10 109.04±21.27 模型组 7 491.31±92.61△△
西药组 9 417.94±71.18 低量组 9 439.73±62.42★ 中量组 9 348.66±56.47▲▲★ 高量组 10 309.49±43.09▲▲★★ |
[注] 与正常组比 △△P<0.01 与模型组比 ▲▲P<0.01
与对照组比 ★P<0.05 ★★P<0.01
4 讨论
AD属中医学的呆病、郁证、文痴等范畴，以本虚标实为主要特征，本虚在于肾的精气不足，标实在于痰浊，一方面肾虚为主的脏腑功能失调可导致痰浊的产生，即因虚致实，另一方面，痰浊为患又可影响气血津液的化生和运行，致本虚更甚，即因实而致虚，两者互为因果，形成恶性循环，以致病程缠绵，见症多端，所以本病应以补肾化痰为基本治法。
CaMK II 是一种多功能蛋白激酶，尤其在神经组织中含量丰富，在脑部某些区域如海马占总蛋白的2%。其在神经系统中发挥多种生理功能，广泛参与了基因的转录调节、神经递质的合成与释放、细胞骨架蛋白磷酸化、微管功能的调节、海马学习和记忆以及突触可塑性调节等多种生物学过程。越来越多的证据表明CaMK II-α在学习记忆过程中起重要作用。CaMK II-α基因敲除小鼠表现长程动作电位（long term potential,LTP）形成障碍以及海马依赖的空间任务完成障碍。[5] 利用基因突变技术，发现αCaMKIIT286A小鼠空间记忆任务完成显著缺陷，[6] 而且海马位置细胞（place cell）不稳定。
王月菊等[7]研究发现CaMKII-α可能部分参与Tau蛋白过度磷酸化。Singh[8]发现CaMKII-a参与Tau蛋白位点Ser262的磷酸化，此位点磷酸化后对于Tau蛋白从微管上解离尤其重要。有学者认为海马CA1区CaMK II-α活性增强可能促进Tau蛋白的异常磷酸化和PHF的形成。[9]
本实验观察到，模型组大鼠海马组织CaMK II-α表达较正常组明显增加，补肾化痰法干预后，CaMK II-α的表达均较模型组有所减少，其中尤以高量组的表达减少较为明显，中、低量组则次之，提示补肾化痰法在一定剂量范围内也可通过调节CaMK II-α的表达减少AD模型大鼠Tau蛋白异常磷酸化水平。
